2023年11月20日 每日一猜答案：。 答案：ABC。
每日一猜答案分析：

考研备考什么,考研准备哪几门,2021考研要买哪些书,考研准备小刀

肖四+肖八+腿姐背诵手册+1000题+《核心考案》

（1）肖四肖八你现在买的话是预售，肖四11月发货，肖八12月发货

（2）腿姐背诵手册也是后期冲刺的时候背，但是可以提前买哈，可以先背背史纲部分

（3）1000题是必买哈，从7月份开始就准备政治，每天用徐涛的《核心考案》搭配强化班视频课看，然后每看完一章就做一章的1000题。

2、英语

《考研词汇闪过》+《句句真研》+《考研真相》（英语一二）+《阅读的逻辑》

（1）单词书我只买了《考研词汇闪过》，考纲5500+单词都有，划分了高中低频词汇，比较好背，还有赠送的8个小册子，超级划算了。

（2）《句句真研》主要是搭配田静老师的语法视频课看

（3）《考研真相》逐词逐句解析，适合基础薄弱的盆友哈，基础好的也可以，反正就是那里不会都可以在这本书中找到解析，我身边同学基本上都是用这本复习的。

（4）《阅读的逻辑》唐迟老师的书，这就不需要我多说了吧，搭配视频课看yyds！

本子+笔+笔芯

（1）草稿纸/笔记本都行，看你个人的习惯，我是比较喜欢用草稿纸的，因为正式考试的答题纸也是空白的，所以可以提前练习在答题纸上写字

（2）笔的话其实没有什么特别的推荐，笔杆子买三根其实就可以了，红的黑的蓝的就行

（3）笔芯多买点，你要是没有平板的话，还是会靠手写嘛，所以说笔芯会用的很快，三种颜色都买点，比较常用的就是黑色的，多买点黑色的就好，红色的用的不是很多，可以适当减少。

3、生发液、洗发水

生发液的话真的还算是挺有必要（你已经在备考的时候就有点头秃的话）学习真的很费脑子的哈，真的别小瞧你掉发的速度，我是属于从小头发就很多的，以前洗澡看 其他女生都是一大把的头发狂掉，但是我都没有，甚至有的时候感觉头发很多，还想拔掉一些hhhhh（对不起，凡尔赛了）

但是我准备考研的那一年，我的天呀，随便摸一把手掌就有好几根头发……虽然我本来头发就多，但是也经不住这么掉，所以，头秃的朋友们，生发液很有必要！

4、咖啡/茶

（1）咖啡和茶都有相应的提神作用，对咖啡不过敏的盆友可以试试茶哈，或者奶茶也行。我比较喜欢咖啡，但是不及建议大家喝三合一的咖啡，如果想要很提神的话，就要喝无糖的，我是不喜欢很酸的咖啡，所以都买苦的，不酸的，大家可以试试挂耳咖啡，意式的会比较好，没有美式的苦，我常喝的是这个：

（2）茶的话我个人比较喜欢苦荞茶或者大麦茶、毛尖也可以，要么就是蜜桃乌龙茶什么的（我喜欢桃子hhhh）

5、糖+巧克力

这里要提一嘴哈，考研的时候就别减肥了，糖和巧克力的功效是让你不困不饿的，不是让你一条到晚吃，我比较喜欢吃酸一点的糖，比较醒脑，巧克力我喜欢白巧哈哈哈哈哈，而且不喜欢软软蠕蠕的那种，喜欢在冰箱里冻上个几天，吃起来邦脆（巨好吃，大家可以尝试）

6、保健品

蛋白粉、维c啥的都背上，保健品不像药能给你带了立竿见影的效果，但是一定能提高你的免疫力，我的保健品都是我妈给我买的哈哈哈哈，就是安利纽崔莱的（虽然很贵，但是有用）

7、护眼贴/蒸汽眼罩

长时间用眼是很疲劳的，再加上你可能会焦虑晚上睡不着，白天不仅困，眼睛还干涩，疼。

所以真的建议大家买点保护眼睛的东西，内在的外在的都可以

8、耳塞

这玩意因人而异，对于我来说是非常重要的，因为我对声音比较敏感，如果我背书的话，旁边的人是出声背的，我会背不下去，所以我一般都是选择带耳塞一个人默背，知识会在脑子里回荡，这样记忆会更加深刻。

然后另一个作用就是有一个好的睡眠质量，不怕被奇奇怪怪的声音吵醒，有一个好的睡眠一定程度上会帮助你白天的学习效率更高。

9、大水杯/保温杯

我之前备考的时候买了超级大的水杯！让你们康康：

很便宜，容量超级大

还有就是保温杯，我买的是这个，日本经典款，保温效果非常nice！

嗯……其实差不多就这些吧

如果还有其他的，欢迎小伙伴在评论区留言哦~

如果觉得有用，就点个赞吧哈哈哈哈哈哈哈哈哈啊哈哈

---

如何使用李斯特菌 李斯特菌培养方法

李斯怎样,李斯老师,李斯定位,李斯视频
1.本发明涉及生物疫苗技术领域，特别涉及一种重组绵羊李斯特菌及其使用方法。背景技术：2.绵羊李斯特菌(listeria i【【微信】】)和单增李斯特菌(listeria monocytogenes,lm)同属于李斯特菌菌属，能进入巨噬细胞等抗原递呈细胞，并在胞内增殖；li极少引起人类疾病，具有安全性。减毒lm可作为构建疫苗的载体，类似地，li也可以作为构建疫苗的载体，但相较于lm载体疫苗，li载体疫苗在体内免疫器官中存活的时间更短，因此其免疫原性受到很大的限制。因此，利用未经改造的绵羊李斯特菌作为疫苗载体的方案在免疫原性、保护率等方面仍然存在一定的缺陷。3.lm溶血素(listeriolysin o,llo)是一种由李斯特菌的hly基因编码的蛋白，分子质量为58.6～60kd，属于胆固醇依赖性细胞溶解素(cholesterol-dependent cytolysins,cdc)家族的一个成孔毒素，能够协助细菌破坏吞噬体，促进菌体进入胞液，是细菌得以在胞质增殖的先决条件，并且能通过膜穿孔机制帮助lm从内化的宿主细胞液泡逃逸。逃逸出来的细菌分泌的蛋白被蛋白酶体降解加工后通过mhc-i分子递呈给cd8+t细胞，增强抗原递呈。4.li的溶血素(i【【微信】】,ilo)与lm的溶血素(llo)的具体作用不完全相同，有研究者将编码lm溶血素的hly基因替换为编码li溶血素的基因ilo得到一株重组菌lmδhly::ilo，该重组菌可以在小鼠肝脏中增殖，但不能在脾脏中增殖。技术实现要素：5.本发明要解决的技术问题在于现有的利用绵羊李斯特菌作为载体的方案存在缺陷，针对现有技术的不足，提供一种重组绵羊李斯特菌及其使用方法。6.为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：7.一种重组绵羊李斯特菌，其特征在于，所述重组绵羊李斯特菌包含单增李斯特菌的hly基因，且ilo基因缺失、失活或突变。8.可选地，所述重组绵羊李斯特菌的ilo基因片段缺失。9.可选地，hly基因的启动子与重组前所述ilo基因的启动子序列相同。10.可选地，hly基因位于重组前ilo基因所在的区域。11.可选地，所述重组绵羊李斯特菌还包括异源性抗原。12.可选地，hly基因的核苷酸序列如seq id no:19所示。13.一种疫苗，所述疫苗包含如上所述的重组绵羊李斯特菌。14.一种在受试者中引入免疫应答的方法，将表达异源性抗原的异源基因导入如上所述的疫苗载体，得到目标疫苗；15.给受试者施用有效量的所述目标疫苗。16.有益效果：本发明是在li菌株的基础上，敲除li溶血素(即ilo基因表达的蛋白)，6，b为il-4，c为ifn-γ，d为tnf-α，e为il-12，*表示与li组比较有统计学差异，p《0.05，#表示与pbs组比较具有统计学差异，p《0.05；33.图10为本发明中两次免疫小鼠后的保护率，*表示p＜0.05(与li相比)，#表示p＜0.05(与pbs相比)。具体实施方式34.本发明提供一种重组绵羊李斯特菌及其使用方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。35.本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)，具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语，应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样被特定定义，否则不会用理想化或过于正式的含义来解释。36.研究发现，将结核分枝杆菌抗原插入li基因组获得一株重组细菌，免疫小鼠可引起以分泌ifn-γ为主的抗原特异性cd8+t细胞免疫反应，证实li可作为构建疫苗的载体。37.本发明为提高li作为疫苗载体的安全性和免疫原性进行改良，提供了一种将li溶血素基因ilo替换为lm溶血素基因hly的技术方案，得到溶血素经过改造的重组li菌株liδilo::hly，该改造株安全性、免疫原性、免疫保护率相较li大大提升，可作为更优良的疫苗载体用于疫苗的制备领域。38.在本发明提供的一个实施例中提供一种重组绵羊李斯特菌，所述重组绵羊李斯特菌包含单增李斯特菌的hly基因，且ilo基因缺失、失活或突变。在一个实施例中，该ilo基因在重组绵羊李斯特菌中的片段是缺失的，在另一个实施例中，hly基因的启动子与重组前所述ilo基因的启动子序列相同，相当于hly基因对ilo基因进行了回补。在可选的方案中，hly基因位于重组前ilo基因所在的区域。在另一个可选的方案中，重组绵羊李斯特菌还包括异源性抗原，以用于制备疫苗。其中，该异源性抗原可包括肿瘤细胞的特异性抗原。此外，hly基因的序列可如seq id no:19所示。39.本公开的一个技术方案中，分子克隆和载体构建方法是本领域公知的，任何这种方法都可用于产生构建体以提供元件如双链断裂诱导酶，人工靶位点，靶向载体，细胞增殖因子或任何其它的有用元件。使用标准分子生物学技术进行载体构建。可以使用任何转化方法，载体构建和/或插入制品可以据此修饰。40.在一个实施例中，本发明还提供一种疫苗载体，该疫苗载体包含重组绵羊李斯特菌。该疫苗载体可制备针对哺乳动物癌细胞的疫苗，本公开使用的癌细胞包括任何癌症的恶性肿瘤细胞。“哺乳动物”包括人或非人类。41.在一个公开的技术方案中，为了建立预存免疫力，本公开的方法包括将表达异源性抗原的异源基因导入如上所述的疫苗载体，得到目标疫苗；给受试者施用有效量的所述目标疫苗。该类表达异源性抗原的实例包括癌胚抗原(oncofetal antigen)(例如甲胎蛋白，afp)和癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，cea)、表面糖蛋白(例如ca125)、癌基因(例如her2)。正如本领域技术人员应理解的一样，可根据针对的细胞对象，选择抗原，因为一种或多种抗原可能特别适用于治疗某些癌症。例如对于治疗黑素瘤，可以使用黑素瘤相关抗原，例如dct。42.在一个实施例中，本文提供诱导受试者中免疫应答的方法，该方法包括向受试者试用包含本文提供的重组绵羊李斯特菌，从而诱导免疫应答。用以下若干方法的任一种将抗原或疫苗给予哺乳动物，包括但不限于静脉内、肌内或鼻内。正如本领域技术人员应理解的一样，可在合适的溶媒(例如盐水或其它合适的缓冲液)中给予抗原或掺有抗原的载体。在用选定肿瘤抗原接种后，在免疫应答间隔期内，例如约4天内并延长达数月、数年或可能终身，哺乳动物产生免疫应答。该施用方法包括静脉内或经口施用，在一个实施例中，即采用静脉注射的方式施用。43.本公开中的“本领域的常规生物学方法”，可以参见“最新分子生物学实验方法汇编(current protocols in molecular biology，wiley出版)”，“分子克隆实验指南(molecular cloning：a laboratory manual，冷泉港实验室出版)”等公开出版物中记载的相应方法。44.示例性的，本公开采用的绵羊李斯特菌为li pam55(zhou m,jiang m,ren c,liu s,pu q,【【微信】】,shen h,wang c.listeria i【【微信】】nfection in mice:restricted to the li【【微信】】d replication in the spleen.front microbiol,2016,7:790.)；单增李斯特菌为lm 10403s(mahdy se,liu s,su l,zhang x,chen h,pei x,wang c.expression of the 【【微信】】grated chromosomally with mutant listeria monocytogenes strain induced both humoral and cellular immune responses.appl microbiol biotechnol,2019,103(4):1919-1929.)。需要补充说明的是，其他不同来源的绵羊李斯特菌和单增李斯特菌也同样适用本实施例。45.实施例1：构建用于敲除ilo基因的第一打靶质粒，以及用于回补hly基因的第二打靶质粒46.具体地，本实施例中用于敲除ilo基因的打靶质粒主要用于使绵羊李斯特菌中的ilo基因缺失、失活或突变，从而影响绵羊李斯特菌本身的溶血素发挥功能。因此，条件性敲除、利用随机突变进行基因敲除、rnai引起的基因敲除、基于同源重组的基因敲除等方式都可作为可选的敲除ilo基因的手段，基于手段的不同，后续可引起绵羊李斯特菌中的ilo基因缺失、失活或突变。47.为了方便说明，本实施例采用基于同源重组的基因敲除方式，第一打靶质粒为包含ilo基因的上下游同源臂的质粒。在构建过程中选用的酶切位点、pcr引物等都可根据菌株的特性等调整。48.此外，hly基因是单增李斯特菌中表达溶血素的基因。构建的重组绵羊李斯特菌具有两个特征，一个是包含单增李斯特菌的hly基因，另一个特征是绵羊李斯特菌本身的表达溶血素的ilo基因存在缺陷，该缺陷可包括缺失、失活或突变。49.导入hly基因可采用病毒感染、基因定点插入等方式。病毒感染存在插入位置不确定的风险，而针对基因定点插入，可以选择将hly基因片段和启动子一同导入至绵羊李斯特菌中的非编码蛋白区域，也可以选择将ilo基因的启动子负责启动hly基因，以达到重组前和重组后绵羊李斯特菌的溶血素表达水平一致。50.1.1制备第一载体质粒的载体骨架片段51.首先获取用于构建第一打靶质粒的第一载体质粒，本实施例采用pcw107(wang c,zhang f,yang j,khanniche a,shen h.expression of porcine respiratory and reproducti【【微信】】ane-associated proteins in listeria i【【微信】】a a genome site-specific integration and expression system.j mol microbiol biotechnol,2014,24(3):191-195.)作为第一载体质粒，其具有xbai、noti等酶切位点。本实施例按照omega质粒提取试剂盒说明书操作提取质粒pcw107。52.然后对第一载体质粒进行酶切并回收，得到可用于连接ilo基因上下游同源臂的载体骨架片段。取质粒pcw107以限制性内切酶xbai和noti酶切，酶切体系按试剂说明进行。37℃水浴1h进行酶切后加入0.5μl碱性磷酸酶(ciap)，37℃水浴30min去磷酸化。然后将酶切混合物与适量6×loading buffer混合，在质量浓度1％的琼脂糖凝胶、94v的条件下进行电泳(以下电泳条件均于此相同)。成像后切下目的片段(7449bp)，按照omega dna产物纯化试剂盒说明书回收载体片段，以35μl elution buffer洗脱，并用nanodrop对上述dna片段进行浓度及纯度检测。53.1.2克隆ilo基因的上下游同源臂54.挑取脑心浸液肉汤培养基(brain-heart infusion broth,bhi)平板上的单个li菌落于100μl纯水中，沸水浴煮沸15min，离心取上清作为模板。55.针对上游片段，使用快速高保真pfu酶以引物对“li-ilo-up-f，【【微信】】”扩增1060bp长的一段序列【【微信】】(li-ilo基因上游同源臂)，pcr体系和反应程序见表1和表2，反应产物电泳，在紫外成像系统中切下含目的片段的凝胶，进行胶回收，以35μl elution buffer洗脱，并用nanodrop定量。其中，li-ilo-up-f序列如seq id no:5，【【微信】】序列如seq id no:6。56.表1pcr扩增体系57.pcr体系体积(μl)i-5tm2×high-fidelity master mix12.5引物-f1引物-r1模板8ddh2o2.5总体积2558.表2pcr扩增条件[0059][0060]pcr扩增产物进行酶切和胶回收。由于上下游同源臂的长度较长，因此，采用分段连接的方式，将上下游同源臂依次连接至pcw107质粒上，对于上游同源臂酶切采用的是xba『not≌饬礁雒盖形坏悖采用表3的酶切体系进行酶切。[0061]表3酶切体系[0062]酶切体系加入量(μl)【【微信】】＜1μgxba1not110×buffer2ddh2o加至20总体积20[0063]将上述酶切混合物与适量6×加样缓冲液混合后上样电泳，结束后于凝胶成像分析仪照紫外检测，并迅速切下目的片段，按照omega胶回收试剂盒说明书操作回收目的片段，洗脱后利用nanodrop对回收片段进行定量。[0064]针对下游同源臂，采用与上游同源臂类似的方法扩增、酶切和回收，所用扩增引物为li-ilo-down-f，【【微信】】，所用限制性内切酶为speii和noti。其中，li-ilo-down-f序列如seq id no:7，【【微信】】序列如seq id no:8。[0065]1.3构建包含ilo基因上下游同源臂的第三打靶质粒[0066]具体地，如图1所示，先将ilo基因的上游同源臂酶切回收片段(插入片段)与第一载体质粒骨架片段连接。将酶切和去磷酸化后的载体线性骨架片段和插入片段分别按表4混匀后，50℃连接15min。将连接产物按热休克法转化至大肠杆菌dh5α，涂布于la平板(含100μg/ml氨苄青霉素(amp)溶液的lb平板)，37℃培养16～20h。[0067]表4连接体系的配制[0068]连接体系体积(μl)质粒载体50ng插入片段摩尔比为5:1sosoo mix1ddh2o加至10共计10[0069]其中，采用的sosoo mix为trelief公司的无缝克隆试剂盒提供的混合液。[0070]然后挑选平板上单个白色菌落进行增菌培养，分别以引物li-ilo-up-f，【【微信】】进行扩增筛选，pcr体系中酶换成2×ta【【微信】】，其余成分和反应程序与表1、表2相同，反应产物电泳检测。然后将pcr筛选阳性的菌落以la肉汤(含100μg/ml amp溶液的lb肉汤)增菌，提质粒，以xbai和noti进行酶切，酶切结束后，酶切混合物进行电泳检测。最后按前述方法提取pcr筛选和酶切验证均符合预期的质粒，送往测序公司进行测序验证。将测序验证后完全正确的阳性质粒分别命名pcw618(序列如seq id no:1)，携带阳性质粒的大肠杆菌保存于-20℃和-80℃。[0071]然后将下游同源臂连接至pcw618中，得到第三打靶质粒。采用spei『not《pcw618进行酶切、去磷酸化和回收，回收片段长7376bp。[0072]采用与连接上同源臂类似的方式，将下游同源臂与酶切pcw618回收的片段进行连接、转化、pcr筛选和酶切筛选。其中，pcr筛选引物为li-ilo-down-f，【【微信】】，酶切筛选所用限制性内切酶为speii和noti，获得重组质粒命名为pcw619(序列如seq id no:2)，即第三打靶质粒。[0073]1.4构建第一打靶质粒和第二打靶质粒[0074]具体地，先采用noti对第三打靶质粒pcw619进行酶切、去磷酸化和回收，得到第二载体片段。[0075]对lacz基因进行扩增，并插入到第三打靶质粒中，得到第一打靶质粒。其中，lacz基因采用的扩增引物为lacz-f和lacz-r，采用not〗行酶切。后续将扩增的lacz基因连接到第三打靶质粒pcw619中，转化、筛选和验证，pcr筛选引物为lacz-f和lacz-r，酶切筛选所用限制性内切酶为not　Ｗ钪盏玫叫带lacz基因的第一打靶质粒pcw620(序列如seq id no:3)。其中，lacz-f序列如seq id no:9，lacz-r序列如seq id no:10。对hly基因进行扩增，并插入到第三打靶质粒中，得到第二打靶质粒。其中，hly基因采用的扩增引物为hly-f，hly-r，采用not〗行酶切。后续将扩增的hly基因连接到第三打靶质粒pcw619中，转化、筛选和验证，pcr筛选引物为hly-f和hly-r，酶切筛选所用限制性内切酶为not　Ｗ钪盏玫叫带hly基因的第二打靶质粒pcw621(序列如seq id no:4)。[0076]实施例2：构建重组绵羊李斯特菌[0077]在本实施例中，先将第一打靶质粒pcw620导入绵羊李斯特菌中。由于第一打靶质粒包含ilo基因的上下游同源臂，且在同源臂之间连接有lacz基因，因此在绵羊李斯特菌发生dna复制时，利用同源重组，可将绵羊李斯特菌中的ilo基因敲除，并引入第一打靶质粒上的lacz基因。一方面，在ilo基因缺陷且包含lacz基因的绵羊李斯特菌中可引入第二打靶质粒pcw621，第二打靶质粒包含ilo基因的上下游同源臂且同源臂之间连接有hly基因，利用同源重组，绵羊李斯特菌中的lacz基因可被hly基因替代，从而得到本方案所描述的重组绵羊李斯特菌。另一方面，在ilo基因缺陷且包含lacz基因的绵羊李斯特菌中引入第三打靶质粒pcw619，由于该质粒不包含lacz基因但包含ilo基因的上下游同源臂，因此可利用同源重组，将绵羊李斯特菌中的lacz基因敲除，从而得到ilo基因缺陷的绵羊李斯特菌，可作为重组绵羊李斯特菌的对比菌株。[0078]2.1制备绵羊李斯特菌的感受态细胞[0079]挑取bhi平板上新鲜培养的li菌落接种于15ml含0.5mol/l蔗糖的bhi肉汤，37℃180rpm过夜培养；将上述肉汤培养物全部接种于250ml含0.5mol/l蔗糖的bhi肉汤，37℃180rpm摇育，以含0.5mol/l蔗糖的bhi肉汤调零，定期测定a600值；当a600值达到0.4时，加入盘尼西林g(终浓度为12.5μg/ml)，混匀后继续摇育；当a600值达到0.7时，将肉汤培养物分装至50ml离心管，4℃13000rpm离心5min，弃上清；加入20ml0.5mol/l蔗糖溶液洗涤沉淀，4℃10000rpm离心10min，弃上清；重复洗涤1次；每管加入300μl 0.5mol/l蔗糖重悬，50μl/支分装1.5ml ep管，-80℃保存。[0080]2.2制备ilo基因缺失且引入lacz的绵羊李斯特菌株[0081]先将第一打靶质粒转入绵羊李斯特菌的感受态细胞中。为了提高转入效率，本实施例采用电转的方式，先取感受态细胞li冰浴自融；用预冷的枪头吸取5μl打靶质粒pcw620加入50μl上述感受态细胞中；轻柔混匀，冰浴5min；将液体转移至预冷的电转杯中，冰浴5min；在电压1500v条件下电击5ms；点击后电转杯取出冰浴5min，加入预热750μl含1mol/l蔗糖的bhi肉汤，30℃，150rpm摇育2h；将菌液涂布于be3-x-i平板，其中，be3-x-i平板是bhi琼脂灭菌后加入红霉素(【【微信】】)溶液(ery终浓度为3μg/ml)得到。在be3-x-i平板中，平板表面涂布40μl x-gal和8μl iptg，37℃培养48-72h。[0082]电转后，基于蓝白斑筛选和质粒本身的抗性，在平板上挑选出单个蓝色菌落进行增菌培养，并进行后续的鉴定。[0083]本实施例采用的鉴定方式包括pcr筛选和质粒筛选。pcr筛选时分别采用三对引物进行pcr筛选。第一对引物为li-ldh-f和【【微信】】，用于检测乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,ldh)基因，作为阳参；第二对引物为ery-f和ery-r，用于检测第一打靶质粒上的ery抗性基因；第三对引物为lacz-f和lacz-r，用于检测第一打靶质粒上lac-z基因。此外，将pcr筛选的阳性菌接种于be10肉汤(含10μg/ml ery溶液的bhi肉汤)，30℃180rpm过夜培养；取新鲜菌液于1.5ml ep管中，13000rpm离心1min，弃去上清；加入250μl含有20mg/ml溶菌酶的solution i(含rna酶)，重悬细菌沉淀，于37℃水浴45min进行破壁；其余步骤按omega质粒提取试剂盒说明书操作提取质粒，电泳检测。其中，li-ldh-f序列如seq id no:13，【【微信】】序列如seq id no:14，ery-f序列如seq id no:17，ery-r序列如seq id no:18。[0084]将pcr筛选和质粒筛选后的菌株作为电转成功的菌株，用于后续的同源重组。在温度和红霉素抗性双重压力下连续传3代，以使第一打靶质粒插入片段与受体菌基因组间发生第一次基因同源重组。[0085]将第3代平板生长出的蓝色菌落接种至bhi肉汤中，撤除红霉素及温度压力，30℃，180r/min培养24h连续传代培养6代以使打靶质粒与受体菌基因组间发生第二次同源重组，同时脱质粒，从而将ilo基因的上游同源臂和下游同源臂之间的基因片段，也就是ilo基因片段，替换为第一打靶质粒上的lacz基因。取第3、4、5、6代肉汤培养物，10倍稀释至稀释度为10-7、10-8、10-9，取100μl稀释后的菌液分别涂布于be3-x-i和b-x-i平板(bhi平板，使用前涂布x-gal和iptg)，30℃下培养48h。[0086]然后挑取第6代b-x-i平板上长出的蓝色菌落分别划线接种be3-x-i平板和b-x-i平板，30℃培养48h；挑取b-x-i平板上长出蓝色菌落且在相应be3-x-i平板未生长的菌落进行pcr验证。挑取符合蓝白斑预期和红霉素抗性筛选的菌落，分别以引物li-ldh-f，【【微信】】、ery-f，ery-r和lacz-f，lacz-r进行pcr筛选，pcr体系中酶换成2×ta【【微信】】，其余成分和反应程序与表1、表2相同。pcr结束后电泳观察。[0087]最后，对pcr筛选的阳性菌株测序验证，将测序验证后完全正确的阳性菌命名为liδilo::lacz，分别保存于-20℃和-80℃。[0088]按照前述制备绵羊李斯特菌的感受态细胞的方式，制备liδilo::lacz感受态，并将第三打靶质粒pcw619电转入liδilo::lacz感受态细菌中，按前述方法进行同源重组，用引物对菌株进行筛选，其中，第一个引物对为ilo-f和ilo-r，第二个引物对为lacz-f和lacz-r，本次筛选是挑选ilo基因缺失且不携带lacz基因的菌株。pcr筛选后符合条件的阳性菌株进行测序验证，将测序验证后完全正确的阳性菌命名为liδilo，简称为溶血素缺陷株，即ilo基因缺失的绵羊李斯特菌株。其中，ilo-f序列如seq id no:11，ilo-r序列如seq id no:12。[0089]2.3制备重组绵羊李斯特菌株[0090]按照前述步骤制备liδilo::lacz感受态，然后将第二打靶质粒pcw621电转liδilo::lacz感受态细菌中，按前述方法进行同源重组，用引物对hly-f与hly-r进行pcr筛选出成功回补hly基因的菌株，对pcr筛选的阳性菌株进行测序验证，将测序验证后完全正确的阳性菌命名为liδilo::hly，简称为溶血素改造株，即重组绵羊李斯特菌。其中，hly-f序列如seq id no:15，hly-r序列如seq id no:16。[0091]实施例3：重组李斯特菌的体外生长特性[0092]挑取平板上lm、li、liδilo、liδilo::hly单个菌落分别接种于5ml bhi肉汤37℃培养24h，再吸取一定量的上述菌液接种于40ml bhi肉汤，置于摇床37℃，200rpm扩大培养，调节各菌液初始的a600值为0.05左右，每隔1h吸取3ml菌液测定并记录a600值(共连续测定11h)，记录各个时间点a600值并绘制生长曲线，该实验独立重复三次，实验结果见图2。结果显示liδilo::hly、liδilo在各个时间点生长速度及生长趋势均与li保持一致，且生长差异不具有统计学意义，表明绵羊李斯特菌溶血素敲除及回补后，重组菌株体外生长未受到明显影响。[0093]实施例4：重组李斯特菌在鼠巨噬细胞内增殖能力测定[0094]首先将鼠巨噬细胞复苏，以便进行实验。从液氮罐中取出冻存的raw264.7巨噬细胞，置于37℃水浴锅中快速融化，转移到含5ml dmem培养液的无菌离心管中，1000rpm离心5min后弃去上清，加入4ml含体积浓度20％的胎牛血清(fbs)的dmem(20％fbs-dmem)(含抗生素)培养液重悬，转移至细胞培养瓶中，置于co2培养箱中37℃培养。每天观察细胞生长状况，当细胞密度达到80％～90％进行传代。[0095]细胞传至第3代，洗涤、消化后将细胞吹打到20％fbs-dmem(不含双抗)培养液中制成细胞悬液，取适量悬液与苔盼蓝混合后用细胞计数板进行计数。将适量细胞悬液接种至24孔细胞培养板中(每孔1×106个)，每孔再加入1ml含体积浓度10％的fbs的dmem(10％fbs-dmem)(不含抗生素)培养液，置于co2培养箱37℃过夜培养。[0096]同时，准备需要与巨噬细胞共培养的细菌，吸取250μl过夜培养的新鲜lm、li、liδilo、liδilo::hly菌液，接种于5ml bhi肉汤，37℃180rpm摇床中培养，定时测定a600值，当a600值为0.4时，取出试管。将试管中的菌液转移到15ml离心管中，4℃13000rpm离心5min，弃上清，用5ml pbs洗涤，4℃13000rpm离心2min，弃上清，用5ml含10％fbs-dmem培养液重悬细菌置于冰上备用，此时细菌浓度约为108cfu/ml。[0097]然后将重组李斯特菌细菌感染巨噬细胞。将24孔细胞培养板取出，弃去培养液，用pbs洗涤2次，加入900μl 10％fbs-dmem(不含双抗)培养液。以moi约20：1的感染量加入100μl菌液，晃动培养板使细菌分布均匀，于37℃co2培养箱中作用1h。根据接种的细菌分为4组：①lm；②li；③溶血素缺陷株liδilo；④溶血素改造株liδilo::hly。[0098]感染后，将未能进入巨噬细胞的胞外细菌灭杀，弃去培养液，pbs洗涤2次，加入1ml含200μg/ml庆大霉素的10％fbs-dmem培养液(不含双抗)，37℃co2培养
..互助群天猫微信怎么加,互助群天猫微信怎么加,支付宝喵币组队,群里的小伙伴都超友善！2023 618淘宝理想生活狂欢季互帮互助，共同成长。加入吧！ 快进来,最新淘宝理想生活狂欢季天猫助力群二维码2023最新,天猫618 狂欢盛典互助群天猫微信怎么加,2023年 618淘宝狂欢盛典支付宝喵币组队，上万人一起互助